蔡司显微镜 | 如何用激光共聚焦进行共定位研究

Release time: 2024-04-25


问题困扰

• 我感兴趣的蛋白A和蛋白B好像具有某种功能联系,怎样直观“看”到这种关联?

• 这段mRNA对蛋白表达好像具有调控作用,怎样论证?

• 我对细胞和实验动物施加了药物处理,药物在细胞、器官内的转归、代谢过程为何?

使用激光共聚焦进行共定位分析,为解决上述困扰提供了合适途径,在提供直观的图像结果同时,给出相应的数值化指标用以评估共定位程度,可以说激光共聚焦架起了视觉判断定量分析的桥梁

秘籍总结

高图像质量、高分辨率:高数值孔径成像物镜、扫描速度与平均策略是关键,Airyscan超高分辨模式同样提供Buff加成

避免串色:采用Best signal顺序采集是关键

避免过曝:打开Region Indicator小工具,直观有效判断过曝

光切厚度一致:Match Pinhole一键匹配所有通道的光切厚度

• 制备单一标记样本,并在不同样本成像时,Reuse 复用参数

数据分析:ZEN软件Colocal工具中“规定Threshold-选定分析ROI-比对共定位参数“三步走

案例分享

此案例所示是一个标记了线粒体内膜蛋白Tom20(绿色荧光)与线粒体外膜蛋白ATP5a(红色荧光)的Cos7细胞样本,在进行Airyscan超高分辨成像后,使用ZEN软件Colocal工具进行共定位分析:

在Colocal界面中,如下工具可以让你事半功倍:

形状工具:选定分析ROI,只有针对区域的共定位分析才是有意义的,在此案例中以细胞边界作为参考较为符合目的

Threshold工具:分割信号与背景的关键

伪彩工具:一眼看出“共定位在哪里”,如上图中的洋红色区域

图表工具:展示或提取散点图、表格,共定位参数直观可查

最后,基于得到的Pearson系数、Manders系数等,进行共定位程度评估,为揭示蛋白之间的功能关联、mRNA的表达调控作用、药物在机体内的转归与代谢过程提供佐证。

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