从图像到结果 | 应用于细胞谱系追踪的高级图像分析

Release time: 2024-02-27


在我们“从图像到结果”系列的推文中,我们将为您带来不同类型的研究案例,探索如何从您样本的显微图像中以快速有效的方式量化数据结果。

在本期案例中,蔡司君将与您分享如何使用arivis Pro图像分析软件实现对秀丽隐杆线虫早期胚胎的细胞分裂过程进行量化分析。

实验与方法

▲ 图1A:整个时间序列内线虫胚胎的最大强度投影展示,通过中心体的分裂和膜的区室化观察细胞分裂活动。

分析细胞分裂的周期及细胞的区室化,如图1A所示,研究人员对线虫胚胎做了三种标记:细胞膜(PH-mKate2)、细胞核(H2B-mCherry)和中心体(gammaTub-GFP),并利用蔡司晶格层光显微镜Lattice Lightsheet 7对活体线虫胚胎样本进行连续两个小时的图像采集。其中,细胞膜与细胞核均用绿色通道采集,中心体用红色通道成像。

分析结果如图1B所示,使用arivis Pro对该时间序列图像进行高级量化分析。

▲ 图1B:时间序列内线虫胚胎图像的最大强度投影展示,附加中心体的数量、平均体积和球形度随时间变化的曲线图。

图像分析

▲ 图2 arivis Pro图像分析工作流程

在本案例的图像分析过程中,整体图像分析流程如图2所示。其中,最重要的一步是分割出中心体和细胞区室。

▲图3A:中心体的原始数据与分割对象同步显示。根据时间点的不同对中心体的分割对象进行颜色编码(从紫色到红色)。

首先是中心体的分割,如图3A所示,我们使用背景校正降噪的方法对图像做预处理,然后使用分水岭(watershed)分割法分割出每个时间点上的中心体。

▲ 图3B:细胞区室分割验证。随机颜色显示的透明轮廓是细胞区室的分割结果,青色分割对象代表中心体,绿色是原始数据膜结构。

其次是分割细胞区室,如图3B所示,对图像进行预处理之后,我们以中心体为种子,以细胞膜为边界,使用种子区域生长(Seeded Region Growing)分割法对每个时间点的细胞区室进行充分分割。最后,根据不同时间点,对分割的中心体和细胞区室进行分组,提取出它们的数量、平均体积平均荧光强度等参数

图像分析结果

有丝分裂的结果表征及统计分析

有丝分裂是早期胚胎发育的一个突出特征,而且是非常快速的连续过程。因此,对于这类图像数据,时间空间特征是细胞分裂过程中主要获取的特征参数。

为了对分析结果赋予生物学意义,我们以细胞内的中心体为例。从图3A中可以看出,中心体在整个细胞周期内呈典型的“增长”模式,在细胞分裂间期中心体尺寸很小,在分裂期它的尺寸急速增大。

▲ 图4A:每个时间点中心体的平均体积。图4B:每个时间点中心体的平均荧光强度。垂直线识别有丝分裂波峰。

在图4A和4B中,我们描绘了中心体的平均体积平均总荧光强度随时间变化的曲线,这两组数据的读出曲线的走向几乎相同。从曲线图中的四个峰值可知,整个时间序列内有四个有丝分裂波。测量两波之间的距离发现,平均细胞周期越来越长,第一波峰和第二波峰之间细胞周期的时长约17.3分钟,第三和第四波峰之间细胞周期约32分钟。

▲ 图4C:有丝分裂波的半峰宽(FWHM)。

另外,随着有丝分裂的周期迭代,有丝分裂波的峰值逐步变宽,这表明细胞有丝分裂越来越不同步。为了量化这一特性,我们测量了有丝分裂波的半峰宽(FWHM),如图4C所示,图中可以看出,第一个有丝分裂波的半峰宽是5分钟,第四个有丝分裂波的半峰宽是18分钟。

细胞的定量

我们关注的另一个特征值是胚胎内细胞的数量,通常我们以细胞核的计数为准。而在细胞核荧光强度表达极低的情况下,我们选择中心体计数来表征细胞的数量,因为当细胞处于分裂间期,每个细胞只有一个中心体,当细胞进入有丝分裂期,中心体才分裂形成两个有丝分裂纺锤体极体。

▲ 图5A:每个时间点的中心体的数量。垂直线代表有丝分裂波峰,水平线代表有丝分裂峰值区间内中心体的数量。

图5A显示了整个时间序列内中心体的数量。从图中可以看出,细胞每经历一次分裂,我们都能观察到中心体的数量增加了一倍,这表明在每一次的细胞分裂周期中,几乎所有细胞都发生了有丝分裂。图中水平线与垂直线相交处突显了经过细胞分裂周期后中心体的数量,即第一次有丝分裂之后有12个中心体,第二次有丝分裂之后有24个中心体,第三次有丝分裂之后有46个中心体,第四次有丝分裂之后有88个中心体。

▲ 图5B:中心体的球形度。垂直线代表有丝分裂波峰。

此外我们还发现,中心体的球形度与细胞分裂密切相关。如图5B所示,我们描绘了中心体的球形度随时间变化的曲线。数据表明,当细胞处于有丝分裂间期,中心体近似于球形,而在有丝分裂期,中心体球形度数值急剧下降,中心体发生严重变形。

细胞区室的特征

同样地,我们还可以提取细胞区室的特征参数,从而获取更多胚胎发育动力学的相关信息。

▲ 图6A:整体胚胎体积,即每个时间点细胞区室体积的总和。

通过分析早期胚胎发育特征参数,我们发现新细胞的产生优先于胚胎的绝对体积增长。如图6A所示,在经历四次细胞有丝分裂之后,胚胎的总体积没有发生显著变化(图中的异常值表示膜边缘信号几乎未表达,难以检测到完整的胚胎)。

▲ 图6B:细胞区室的平均体积。

因此,随着胚胎内部细胞数量的增加,每个细胞区室的平均体积在逐步减小,如图6B所示。

▲ 图6C:细胞区室的球形度。每个时间点细胞区室球形度的平均值。垂直线代表有丝分裂波峰值。

在图6C中,我们同样也观察到细胞区室的球形度与分裂期有关。假设有丝分裂间期细胞区室呈球形,那么在分裂期,细胞分裂成两个子细胞,细胞区室将被拉长呈椭圆形。

总结

在本案例中,我们使用arivis Pro对秀丽隐杆线虫胚胎在早期发育阶段的显微图像进行高级图像分析,通过高级图像分割方法分割出目标结构,提取它们的特征参数,将细胞分裂过程转化为具有生物学意义的可视化结果

整个时间序列内,胚胎经历了4次明显的细胞分裂。通过提取和分析细胞内的中心体和细胞区室的形态学特征(包括体积、形状、荧光强度等),我们可以得出以下细胞分裂活动特征:

1)细胞分裂在发育初期是同步的、快速的,随后会变得越来越慢,越来越不同步。

2)有丝分裂随着胚胎的逐步区室化,导致细胞体积越来越小。

3)中心体和细胞区室的形状也发生周期性变化,从细胞分裂间期的球形到分裂期被拉伸延长。

随着活体三维成像工具的普及,四维图像动态分析需求大幅增加。在本案例中,研究人员使用蔡司晶格层光显微镜Lattice Lightsheet 7对活体线虫胚胎进行三维成像,显微图像展示了优异的时间和空间分辨率,还原了样本最真实的三维亚细胞结构。同时使用arivis Pro图像分析软件实现了在整个时间序列内从2D、3D层面自动对细胞或者亚细胞结构进行快速、重复追踪

参考文献

Koreth, J., van den Heuvel, S. Cell-cycle control in Caenorhabditis elegans: how the worm moves from G1 to S. Oncogene 24, 2756–2764 (2005).

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