蔡司Gemini技术再飞跃,光场局域方案助力艺术文物复现

Release time: 2024-01-24


荧光标记是生命科学研究中极其重要的工具之一,可以实现对生物样品的可视化观察和定量分析。免疫荧光是我们常用的荧光标记方法,是利用抗原抗体特异性结合来显示目的蛋白的技术,具有特异性强、灵敏度高、速度快和便于观察等特点。

▲ 牛肺主动脉内皮细胞——细胞骨架(绿):Alexa Fluor 488-鬼笔环肽,线粒体(红):MitoTracker Red CMXRos,细胞核(蓝):DAPI

“为什么别人的荧光图像拍的这么好看?” 你是否也有过这样的疑问。

为了成功地完成免疫荧光标记,获得想要的荧光图像,有两个关键问题:样本制备+合适的成像技术

样本制备

01 准备样品

1)动物组织

动物组织的制样一般包括这样几个步骤:取材固定-脱水-包埋-切片-染色-封片。此前我们已经为大家介绍过石蜡切片的制备,而免疫荧光样品中最常用的切片方法为冰冻切片,能够比较完好地保存多种抗原的免疫活性,新鲜的组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。

2)细胞样品

细胞样品的制样包含固定-染色-封片这三步,只要将细胞固定在合适的固相支持物玻片上,即可进行后续操作。

02 荧光染色

免疫荧光染色的好坏直接关系到免疫荧光染色结果的分辨率高低和准确性等。为了帮助我们更好地获取荧光图像,具体步骤和注意事项如下。

1) 抗原修复

大多数甲醛固定的样品在染色前都需要先修复抗原,因为在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联从而屏蔽了抗原位点,导致抗原无法与抗体结合。抗原修复则是利用化学试剂和热的作用将这些抗原位点重新暴露或修正,以便于后期抗体结合。

通常采用柠檬酸缓冲液(PH 6.0:多数胞浆,胞核蛋白,PH4.5:细胞骨架及骨架相关抗原)充分浸泡样本,微波炉中低火加热修复。

 

▲ 左:未做抗原修复,右:抗原修复后

2) 通透

如果检测的靶蛋白属于胞浆蛋白或细胞核蛋白,需要将细胞膜打孔通透,使抗体更容易进入细胞内。采用0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室温通透20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)。

 3) 封闭

通透后为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合,还需要将样品封闭。封闭液中包含有大量的蛋白质,可以与非特异抗原结合,从而有效避免抗体和非特异性位点结合而造成假阳性结果。因此封闭液蛋白的选择需要与一抗蛋白和目标蛋白种属不同,能将非特异性位点结合以保证后续荧光染色的特异性。

常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清,常温封闭60min。

4) 染色

根据一抗是否直接带荧光标记,免疫荧光染色分为直接染色和间接染色。实际实验中,大部分样品我们都是采用一抗二抗两步的间接标记法来进行信号放大。

首先需要选择合适的免疫荧光染料,再依次将一抗二抗进行孵育和洗脱完成染色。

✓ 一抗孵育:用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例,4℃过夜;

✓ 一抗洗脱:第二天将湿盒拿出复温30 min,用1xPBS洗脱三次,每次5min;

✓ 荧光二抗:用抗体稀释液稀释荧光二抗,室温孵育2 h,注意避光;

✓ 二抗洗脱:用1xPBS洗脱三次,每次洗脱时间可稍长;

▲原代培养大鼠皮层神经细胞团。4色荧光标记,绿色为Cy2标记的微管蛋白,红色为Cy3标记巢蛋白,紫色为Cy5标记DCX,蓝色为DAPI标记细胞核

5) 封片

最后将样本封片,以便于长期保存。用含防淬灭的封片剂进行封片,避免气泡的产生。

接下来就可以在显微镜下观察了。

合适的成像技术

对于荧光成像,蔡司可提供从荧光显微镜、激光共聚焦显微镜到超高分辨率显微成像系统的不同尺度的解决方案,针对不同样品,选择合适的成像技术,有助于我们更好地说明科学问题,推动科研的发展。

运用Airyscan 2技术的蔡司超高分辨率激光共聚焦显微成像系统LSM 9系列——捕捉微弱荧光信号的利器。

✓ 90nm超高分辨率成像

✓ 4-8倍信噪比提升保证优异图像

✓ 高速扫描捕获更多动态信息

✓ 低光毒性成像,减少漂白

✓ 兼顾各种样品,无制样限制

在选择免疫荧光标记时,需要综合考虑具体应用场景、荧光染料的特性、标记效率、合适的显微系统、样品的制备和处理方法等因素,才能获得准确、可靠和高效的实验结果。

无锡灵恩机电设备有限公司是蔡司工业测量代理,主要经营蔡司三坐标、蔡司三维扫描仪(3D扫描仪)、蔡司工业CT以及蔡司工业显微镜等。电话热线:4009699806。

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