蔡司光学课 | 光调制荧光蛋白知多少

Release time: 2023-08-25

发现“微光之路”

发现“微光之路“，即生物学微观研究之路。但随着细胞生物学研究的深入，科学家不满足于标记大细胞器的研究现状，希望标记精度可以提升，甚至可以对单个分子进行精准定位，因此我们就需要一种新型的荧光蛋白和超分辨成像技术，来提高荧光显微镜的分辨率和定位精度。

光调制荧光蛋白，就应运而生了。

光调制蛋白种类

光调制荧光蛋白是一类荧光特性受辐射光波长、强度以及时间控制的一类荧光蛋白。根据调制方式和荧光响应的不同主要分为以下三类 [1]。

光活化荧光蛋白

首个被用于光活化研究的光学指示剂来自水母的绿色荧光蛋白的突变体，通过提高天然发色基团的光转换效率而开发的。

如PA-GFP（Photoactivatable GFP），在紫外光照射下被激活，其最佳吸收光发生偏移，在488nm激发光的照射下发绿光。

因此，这种荧光强度高、对比度好的光活化蛋白可用于观察细胞内蛋白的迁移等动态变化。随后红色光活化荧光蛋白也被陆续开发出来，如PA-mRFP,PA-mCherry等，用于活细胞超分辨成像中的双色标记。

光转换荧光蛋白

光转换蛋白，即在激发光照射后出现了颜色的转换，并且在光转换之前本身就发光。如Kaede蛋白，它在受紫外激发后，Kaede蛋白的发射光谱发生红移，会产生从绿色到红色的光谱转化。光转换后，“红肥绿瘦”的比值会显著增加，更有利于提取有效信号与原始荧光图像以及背景区分开。尤其适用于区分特异性靶标细胞和周围类似细胞，并可以通过追踪红色信号标记的结构随时间变化的动力学。另外从石珊瑚中分离出了多种荧光蛋白变体如mEosFP，KikGR等，均有光转换的功能，为不同实验需求提供多种选择。

可逆光开关荧光蛋白

光活化和光转化荧光蛋白被激发后只能发出不可逆的颜色变化，然而，可逆光开关荧光蛋白却可以在多个光周期的明暗状态之间来回切换。

如Dronpa，一种从石化珊瑚中提取的单体荧光蛋白，预示了新一代的特殊可开关荧光蛋白的诞生。在405nm照射下，呈现绿色荧光态，在488nm照射后不发光进入暗态，这类蛋白可以在打开和关闭之间反复数百次而不被漂白。该优势特征使研究人员能够跟踪和选择性照亮某个特定胞内区域。此外，红色荧光蛋白的突变体rsCherry也被广泛用于超分辨成像。

为了满足不同实验的需求，可以通过FP base网站获取更多最新的荧光蛋白的详细信息。

从标记到可视化

“Resolution is about waves and states. —Stenfan Hell

当Harald和Eric了解到光活化绿色荧光蛋白的特殊可调制性之后，他们找到了解决生物细胞学中精准定位蛋白的这一难题的关键所在：开和关。由此产生了光激活定位显微技术（Photoactivated localization microscopy，PALM）[2]。

PALM利用光调制蛋白的特性，少量多次激活荧光单分子，通过高斯拟合定位荧光分子中心位置，最终可实现对亚细胞器超微结构和单个蛋白的精准定位的高分辨率成像。

蔡司超高分辨率显微成像系统Elyra 7 可同时配备结构光照明（Lattice SIM²）和单分子荧光定位（SMLM）技术。SMLM包括了PALM、dSTORM、PAINT等技术，可实现20nm的横向分辨率；对于Z轴，基于PRILM技术的3D SMLM模式，可获得分子级别分辨率的完整细胞3D数据（50-80nm轴向分辨率）（如下图）。

▲A6细胞中核孔复合物成像（左）；α-微管蛋白和β-微管蛋白的双色成像（右）

不论使用光调制荧光蛋白还是荧光染料标记的细胞结构均可通过Elyra 7的SMLM技术解析分子结构、确定分子间的关系以及获得分子级别分辨率的完整细胞的三维信息。此外还可以通过ZEN软件和ZEISS arivis Pro进行活细胞的四维渲染的可视化以及相关参数的量化。

总结

结构的洞悉是研究功能的前提。光调制荧光蛋白的发现无疑推动了生命科学研究的发展，扩展了生物学家们可利用的有效研究手段。要想发挥荧光蛋白的最大优势，必须有超高灵敏度和性能卓越的硬件设备。对于活细胞的研究来说，Elyra 7可以实现更高的空间分辨率和更快的时间分辨率，并可以进行细胞内分子定性定位、粒子追踪和分子定量等研究，甚至是单个蛋白分子的排列分布、分子间的相互作用等等研究。

参考文献

1、Bourgeois, D., Regis-Faro, A., & Adam, V. (2012). Photoactivated structural dynamics of fluorescent proteins. Biochemical Society Transactions, 40(3), 531–538. doi:10.1042/bst20120002

2、From single-molecule spectroscopy to super-resolution imaging of the neuron: a review Methods and Applications in Fluorescence, 4(2), 022004 - June 2016

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